外源基因進行表達的篩選方法 原核表達和分泌表達的區(qū)別?
主要區(qū)別在于重組元件和基因標記的表達。啟動子和終止子被宿主識別。真核生物可能需要增強子,如果重組進基因組,就需要介導重組的序列。大多數(shù)篩選標記是不同的。在宿主中以質(zhì)粒形式存在的真核表達載體可以被復制。
主要區(qū)別在于重組元件和基因標記的表達。啟動子和終止子被宿主識別。真核生物可能需要增強子,如果重組進基因組,就需要介導重組的序列。大多數(shù)篩選標記是不同的。
在宿主中以質(zhì)粒形式存在的真核表達載體可以被復制。哺乳動物細胞中沒有質(zhì)粒,外源基因整合到基因組中,無法擴增。通過集成多個站點產(chǎn)生多個副本。
如果載體被重組,它不會。;沒關系,它 ■都是一樣的酶消化和連接。細菌轉化也是如此。細菌中也可以加入真核載體。
如果表達,一般是通過ISPG直接轉化細菌表達,表達的蛋白通常以包涵體或分泌蛋白的形式存在。如果這種蛋白來源于真核基因,可能不具備相應的蛋白生物活性,因為原核表達缺乏真核轉錄后的蛋白修飾機制。然而,原核表達的蛋白質(zhì)易于純化,并且易于獲得純化的蛋白質(zhì)用作免疫原。
而真核表達則是通過脂質(zhì)體或
瞬時表達,即瞬時轉染后的初始階段,質(zhì)粒或DN段在細胞內(nèi)是游離的,可以表達,稱為瞬時轉染表達。隨后有兩種馴化的質(zhì)粒或DN段游離在細胞中,一種是降解的,另一種是插入染色體中并能持續(xù)穩(wěn)定表達的。
在載體選擇方面,可以不使用篩選標記進行瞬時表達,如NEO抗G418,但也可以使用穩(wěn)定表達載體進行瞬時表達。
植物瞬時表達系統(tǒng)
當外源基因?qū)胫参锛毎麜r未來有兩種表達瞬時表達和穩(wěn)定表達。在瞬時表達狀態(tài)的基因轉移中,導入細胞的外源DNA和宿主細胞的染色體DNA不整合。一般這些DNA在載體進入細胞后12小時內(nèi)即可表達,持續(xù)時間約80小時。在穩(wěn)定表達狀態(tài)的基因轉移中,導入宿主細胞的DNA整合到細胞的染色體DNA中,以永久形式存在,并能遺傳給后代,形成穩(wěn)定的轉化細胞?;?qū)敕椒煞譃殚g接轉基因方法和直接轉基因方法。