設計引物的主要依據(jù)？底漆設計有三個基本原則：底漆和模板的順序應緊密互補。底漆之間應避免穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構。第三，引物不能在模板的非靶點引發(fā)DNA聚合（即錯配）。引物設計原則？1. 引物長度一般為1

設計引物的主要依據(jù)？

底漆設計有三個基本原則：

底漆和模板的順序應緊密互補。

底漆之間應避免穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構。

第三，引物不能在模板的非靶點引發(fā)DNA聚合（即錯配）。

引物設計原則？

1. 引物長度一般為15-30bp，常用引物長度為18-27bp，但不超過38bp。引物GC含量一般為40%～60%，以45%～55%為宜，上下游引物GC含量和TM值應相近。引物對應的模板序列的TM值應在72℃左右，至少55～80℃，TM值曲線應在72℃左右，5〃～5〃4。Δg值（自由能）反映了底漆-模板結(jié)合的強度。3”端的Δg值較低，絕對值不應超過9，否則不利于反應的正確起始。當3′端雙鏈的Δg值為0～2kcal/mol時，PCR產(chǎn)率接近100%，但在-6時僅為40%，在-8、-5時小于20%。失配率不應超過100，否則會出現(xiàn)非目標波段。然而，對于某些特定的模板序列，我們也應該比較它們在正確位置的啟動效率。如果兩者相差較大，如正確位點的起始效率大于340，而錯誤位點的起始效率為110，很難找到其他更合適的引物，則這對引物是可以接受的；6。FRQ曲線是oligo6軟件引入的一個新指標，它解釋了序列片段的重復概率，在選擇引物7時應使用FRQ值。引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構的能量絕對值不應超過4.5，否則容易產(chǎn)生引物二聚體，降低引物濃度，導致PCR異常。“3”的結(jié)尾不應該是連續(xù)的堿基，GGG或CCC會導致錯誤啟動，3“的最后一個堿基不應該是a或T，如果是，則會導致不匹配；9。退火溫度由公式TM=4*（G C）2*（a T）-5計算。選擇TM值較低的引物的退火溫度作為反應的退火溫度，各引物的TM值最佳匹配，在70～75℃范圍內(nèi)。模板與穩(wěn)定性較差的引物的TM差異越小，PCR效率越高。如果產(chǎn)品預期長度等于或小于500bp，則應選擇末端引物（16-18bp）；如果產(chǎn)品長度為5kb，則應使用引物（24bp）；11。在DNA測序和PCR中，最好使用5”穩(wěn)定端（GC含量較多）和3”不穩(wěn)定端（at含量較多）的引物，可以有效地消除假起始反應。引物與產(chǎn)品的TM值相差過大，最佳溫度為20℃。13底漆改性通常在5”端部進行，如添加限制性部位，同時根據(jù)需要添加保護基。