把目的基因連接到質(zhì)粒上構(gòu)建重組質(zhì)粒時該如何選擇限制性內(nèi)切酶?引物如何設(shè)計(jì)？有許多方法，其中列出了一種或兩種：1。不同的粘性端無法連接。所以，如果我們想連接，我們需要刪除不同的粘性端和連接平端。有兩種方

把目的基因連接到質(zhì)粒上構(gòu)建重組質(zhì)粒時該如何選擇限制性內(nèi)切酶?引物如何設(shè)計(jì)？

有許多方法，其中列出了一種或兩種：

1。

不同的粘性端無法連接。所以，如果我們想連接，我們需要刪除不同的粘性端和連接平端。

有兩種方法可以將粘性端變?yōu)槠蕉耍篕lenow酶或S1核酸酶。

為了減少載體自連接，堿性磷酸酶可用于治療載體。

最后，將載體與目的基因連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。

[2.

設(shè)計(jì)引物，用其自身的限制性位點(diǎn)擴(kuò)增目標(biāo)基因。直接改變目的基因的限制性位點(diǎn)，用與載體相同的限制性內(nèi)切酶對目的基因進(jìn)行酶切，切出相同的粘端。

目標(biāo)基因與載體直接連接。

怎樣構(gòu)建質(zhì)粒？

1. PCR擴(kuò)增目的基因片段，需要設(shè)計(jì)引物，選擇同源序列，根據(jù)質(zhì)粒載體和基因序列選擇限制性位點(diǎn)，純化PCR產(chǎn)物。2根據(jù)引物設(shè)計(jì)的限制性位點(diǎn)對PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物應(yīng)回收利用。三。PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒載體通過連接酶連接。4將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到受體菌（通常為dh5a）中，包被培養(yǎng)過夜。如果T載體上沒有限制性位點(diǎn)，則應(yīng)重新設(shè)計(jì)具有限制性位點(diǎn)的引物。PCR擴(kuò)增后，將T載體酶切后與表達(dá)載體連接。如果T載體上有必要的限制性位點(diǎn)，則直接限制后可恢復(fù)目的片段并連接到表達(dá)載體上。

怎樣設(shè)計(jì)引物克隆已經(jīng)構(gòu)建好的t載體基因來構(gòu)建表達(dá)載體？

如果需要擴(kuò)增特定的基因片段并將其插入載體中構(gòu)建質(zhì)粒，則應(yīng)根據(jù)載體上多克隆位點(diǎn)的限制性位點(diǎn)在目標(biāo)基因片段的上下游設(shè)計(jì)一個序列，并將載體上的限制性位點(diǎn)引入載體中設(shè)計(jì)的順序。

此時，設(shè)計(jì)用于完成PCR擴(kuò)增并在目標(biāo)序列的上游和下游引入限制性位點(diǎn)的兩個序列稱為質(zhì)粒構(gòu)建引物。這樣，擴(kuò)增得到的目的片段兩端就有酶切位點(diǎn)。酶切后與載體連接，載體經(jīng)酶切后形成環(huán)，完成質(zhì)粒的構(gòu)建。