把目的基因連接到質(zhì)粒上構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)該如何選擇限制性內(nèi)切酶?引物如何設(shè)計(jì)？有許多方法，其中列出了一種或兩種：1。不同的粘性端無法連接。所以，如果我們想連接，我們需要?jiǎng)h除不同的粘性端和連接平端。有兩種方

把目的基因連接到質(zhì)粒上構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)該如何選擇限制性內(nèi)切酶?引物如何設(shè)計(jì)？

有許多方法，其中列出了一種或兩種：

1。

不同的粘性端無法連接。所以，如果我們想連接，我們需要?jiǎng)h除不同的粘性端和連接平端。

有兩種方法可以將粘性端變?yōu)槠蕉耍篕lenow酶或S1核酸酶。

為了減少載體自連接，堿性磷酸酶可用于治療載體。

最后，將載體與目的基因連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。

[2.

設(shè)計(jì)引物，用其自身的限制性位點(diǎn)擴(kuò)增目標(biāo)基因。直接改變目的基因的限制性位點(diǎn)，用與載體相同的限制性內(nèi)切酶對目的基因進(jìn)行酶切，切出相同的粘端。

目標(biāo)基因與載體直接連接。

怎樣設(shè)計(jì)引物克隆已經(jīng)構(gòu)建好的t載體基因來構(gòu)建表達(dá)載體？

如果T載體上沒有限制性位點(diǎn)，則應(yīng)重新設(shè)計(jì)具有限制性位點(diǎn)的引物。PCR擴(kuò)增后，將T載體酶切后與表達(dá)載體連接。如果T載體上有必要的限制性位點(diǎn)，則直接限制后可恢復(fù)目的片段并連接到表達(dá)載體上。

構(gòu)建載體的時(shí)候，先用設(shè)計(jì)好的引物PCR所要的目的基因，再和T載體連接，再轉(zhuǎn)化，再小抽，再雙酶切，再和？

理論上，PCR產(chǎn)物可以直接消化和連接。

但是，用酶消化PCR產(chǎn)物時(shí)，無法證明雙酶消化的成功和徹底（PCR產(chǎn)物會(huì)有polyA，必須切斷，但PCR產(chǎn)物和酶消化產(chǎn)物的大小差別不大）。以t載體為培養(yǎng)基，雙酶消化t載體，凝膠運(yùn)行檢測能清晰地看到酶消化產(chǎn)物，并有特異性回收。